一、準備工作（無菌是關鍵）

1. 環(huán)境與儀器

• 提前 30 分鐘開超凈臺紫外燈滅菌，用 75% 酒精擦拭臺面與儀器外殼。

• 連接主機與真空泵，檢查管路密封無泄漏；濾杯、底座 121℃濕熱滅菌 20 分鐘備用。

2. 耗材與試劑

• 備好無菌濾膜（0.45μm，直徑 50mm，有網(wǎng)格面便于計數(shù)）、無菌培養(yǎng)皿、無菌鑷子（酒精燈火焰滅菌）、廢液瓶（加消毒液）。

• 準備稀釋液（無菌生理鹽水）、對應培養(yǎng)基（細菌用 TSA，霉菌 / 酵母用 SDA）、供試品稀釋液。

3. 樣品預處理

• 液體樣品：搖勻后按標準稀釋；固體樣品：無菌均質 / 浸提后取上清；含抑菌成分的樣品需預留沖洗步驟。

二、核心操作步驟（步步有標準）

1. 濾膜安裝（超凈臺內(nèi)無菌操作）

• 無菌鑷子夾取濾膜，有網(wǎng)格面朝上，平整放在濾杯底座支撐篩板上，無褶皺、無氣泡。

• 扣上濾杯并旋緊 / 卡緊，確保密封不漏氣。

2. 樣品過濾（控制流速防破損）

• 無菌轉移規(guī)定體積的供試品溶液至濾杯，避免液面過高。

• 啟動真空泵，打開閥門，控制負壓流速（一般 10–30mL/min），防止濾膜破裂或微生物截留不全。

• 樣品完全濾過（濾膜無明顯水珠）后，先關閥門再關泵。

3. 濾膜沖洗（可選，去抑菌殘留）

• 含防腐劑 / 抗生素的樣品，用無菌生理鹽水沖洗濾膜 3 次，每次 50–100mL，每次沖完再抽干。

4. 濾膜轉移與培養(yǎng)（貼平無氣泡）

• 無菌取出濾膜，菌面朝上平貼于培養(yǎng)基表面，輕壓排盡氣泡。

• 培養(yǎng)皿標記樣品信息，倒置放入培養(yǎng)箱：細菌 30–35℃培養(yǎng) 3–5 天，霉菌 / 酵母 20–25℃培養(yǎng) 5–7 天。

5. 結果觀察與計數(shù)

• 培養(yǎng)結束后，計數(shù)濾膜上菌落數(shù)（CFU），按稀釋倍數(shù)換算樣品微生物限度；記錄菌落形態(tài)、顏色等特征。

三、收尾與維護（延長儀器壽命）

1. 儀器清理

• 濾杯用中性洗滌劑浸泡后軟布擦洗，清水沖凈晾干；陽性樣品過濾后需 121℃滅菌 20 分鐘再清洗。

• 管路用純化水沖凈，廢液按生物危害廢棄物處理。

2. 日常維護

• 定期檢查真空泵負壓與管路密封性；濾膜支撐網(wǎng)避免劃傷，及時更換老化密封圈。

四、小白避坑指南（關鍵注意點）

1. 濾膜安裝必須平整無褶皺，否則易漏液或菌落重疊，導致計數(shù)不準。

2. 過濾流速不能過快，防止濾膜破裂或微生物被沖失。

3. 轉移濾膜時避免用鑷子劃傷膜面，菌面朝上是計數(shù)前提。

4. 全程無菌操作，減少環(huán)境微生物干擾，必要時做陰性對照（僅過濾稀釋液）。